在很多情況下，一臺設計精良的顯微鏡并不一定會獲得良好的成像質量。其主要原因多半是光源未調校好，使標本不能獲得充分的照明所至。顯微鏡標本*的照明狀態應該是明亮、無眩光、而且視場照度是均勻的。 對常規的目視觀察及顯微攝影，有很多種照明的光源。由于價格低廉，使用壽命長，50W或者100W的鹵鎢燈是zui常見的一種。在圖1的顯微鏡圖的底座中，畫出了這種光源。在圖中也詳細描述了典型的現代透射光顯微鏡的光路。在此圖中，鹵鎢燈發出3200K的連續光譜（電壓為9V時）。此光線通過集光鏡和視場鏡然后反射到載物臺下聚光鏡，再到達標本。成像光束由顯微鏡物鏡捕獲后到達目鏡或者由分光鏡分光導入到一個或者幾個攝影接口。當燈源發出的光線照明標本并到達目鏡或附加的照相機的過程中，光線要經過若干透鏡和光欄。在現代顯微鏡中，要獲得*的照明狀態，應該對顯微鏡的光學器件進行校正，使其符合“柯拉照明”的原則。怎樣將透射光和反射光顯微鏡校正到符合柯拉照明的細節我們將在顯微鏡的《透射光》及《反射光》中進行討論。圖1所示的光路為典型的透射光光路，光路中有一些透鏡、光欄、反射鏡和分光鏡。這些器件引導光線穿過整個顯微鏡。 鹵鎢燈在光譜中心為3200K（電源大約為9V時）的狀態下工作，但需要采用色轉換濾片提升色溫進行日光均衡。另外常用的一種光源為75W或者150W氙燈，這種燈有非常高的亮度和很長的壽命，相應的平均輸出與人眼的光譜一致，色溫與日光型膠卷的要求近似。如果要求非常高的亮度，可以采用錫鹵化物燈。在熒光顯微鏡中，常常采用了解100W或者200W的汞燈。在早一些時候，也采用過碳弧燈或鋯燈，但現在很少見。
在反射光顯微鏡中，光路系統中照明光源的調整也是十分重要的，特別是金相、半導體晶片檢查及新型的熒光顯微鏡。反射光顯微鏡也采用多種照明光源（如前面已討論），也可采用柯拉照明的方式調整到*期的狀態。詳細的討論在Kohler illumination for reflected light microscopy中有闡述。反射光顯微鏡的照明光路即為interactive Java tutorials 的標題，也包括下面的一個連接。
在"Photography Through the Microscope"一書中，John Delly認為，提供給學術討論、展覽會和科技出版物的顯微攝影照片，有80%到90%光路校正均不正確，其標本的照明狀況很差。這是顯微觀察和顯微攝影中存在的一個十分嚴重的通病。通過對許多大學實驗室教學顯微鏡的隨機檢查，發現聚光鏡及光源調整不正確的狀況十分明顯。我們認為，聚光鏡和視場光欄不正確的調校，是產生顯微攝影照片缺陷的zui大的原因。
正確照明的必要性未能受到特別的關注。一臺校未經正確校正，價值25，000美圓的顯微鏡的成像水平可能與手持式放大鏡差不多，拍攝影的照片還不及一臺校正到柯拉照明*狀態的，價值2000美圓的顯微鏡。本網頁的相關部份介紹了有關柯拉照明的理論，并用圖形對實施方法進行了解釋（透射光和反射光顯微鏡）。本網頁也采用了各種interactive Java tutorials幫助學生掌握這些重要的概念。
無焦點及非聚焦照明：在一個照明系統中，如果照明光源沒有在光路中的任意位置上形成像點，這樣的系統稱之為無焦點或非聚焦照明系統。在電燈泡未發明之前，顯微鏡工作者只以選擇他們可以選擇的光源作為顯微鏡的照明源。在有日光的時候，使用者可將顯微鏡對準天空（或使用載物臺下反光鏡），利用云層作為天然的散射屏使視場中的照度均勻。在顯微鏡上還設置了一個凹面反射鏡，使照明標本的光線更亮一些。白云和藍天不是光源，它們在在顯微鏡光路中成像，因此屬于無焦點源或非聚集光源。當顯微鏡在室內或晚間使用時，迫使人們使用人造光源。由于這類光源自身的色溫較低，使顯微鏡標本呈現出的顏及色調與自然光照明下有較大的差異，在使用中往往加入各種藍色的濾光片進行補償，使其與自然光照明條件下的色調一致。由于此類照明方式的光源均未在顯微鏡的光路中成像，這些照明均歸類為無焦點或非聚焦照明光源。早期的研究證實，倘若物鏡的zui后一片鏡片被光源充滿，無論是自然光源或人造光源，其光學特性和分辨率并沒有多大的差異。后來，科學家們發現一個十分重要的條件：顯微鏡照明系統的數值孔徑應盡量與物鏡的數值孔徑相同。在19世紀，發明了一種新的“光源聚焦”照明方法（臨界照明或稱之為Nelsonian照明），使顯微鏡的照明條件得到改善。
臨界（或納爾遜）照明：這種照明方法是由英國顯微鏡工作者愛德華納爾遜根據阿貝提出的光學原理發明的。從19世紀到20世紀，臨界照明在顯微鏡中得到了十分有效的應用。至今，在那些只使用外部光源或者不需要顯微鏡攝影的較為價廉的顯微鏡中仍然提倡使用。
納爾遜照明依靠載物臺下聚光鏡將油燈燃燒的亮度均勻的火焰（或其它亮度均勻的光源）成像于標本平面上，使視場的亮度比較均勻。在這種照明方法中，光源的均勻性是一個十分重要的條件。燈源燃燒產生火焰的亮度應相對的均勻，但是其它的光源，例如放大機上的磨砂燈泡、乳白色燈泡或有帶狀燈絲的電燈泡均可在臨界照明中應用。圖2所示為臨界照明的光路圖，它利用一個假設的油燈提供一個均勻的光源。
從油燈的火焰發出的光由聚光鏡匯聚（參見圖2），火焰的像成于載玻片上的標本平面上。實際上，往往成像不可能在火焰的中心上，通常需要重新調整載物臺下的反光鏡使火焰成像于視場中心，使火焰能充滿整個視場。進入顯微鏡的總光量可由通常加在外部的視場光欄（如果有的話）來控制。應有充夠的光線進入顯微鏡并充滿物鏡的后焦平面，可適當地調整聚光鏡的孔徑光欄來達到此目的。成像于焦平面上的光源不很穩定，可能存在一些不均勻的斑點及紋路。可采取稍稍調整一點聚光鏡使其產生一點離焦，使視場更均勻來克服這個缺點。有很多場合，更有效的柯拉照明方法取代了納爾遜照明法。
柯拉照明：本題目將在本的相關章節中作進一步的討論，本文只對它的概貌作一簡明的介紹。在柯拉照明中，光源應成像于聚光鏡的孔徑光欄處，并通過孔徑光欄產生一束平行光照明標本。一個放大的光源像成于聚光鏡的下面（孔徑光欄處），通過聚光鏡產生一個角度很大的能產生標本*分辨率光錐。聚光鏡孔徑光欄的尺寸可用來控制照明標本光錐的數值孔徑，這樣可以扼制不必要的雜散光和眩光。這樣聚光鏡表面的灰塵及玻璃表面的缺陷對視場影響會降至zui小。
在顯微鏡中，光學器件調校的正確與否，將直接影響有效的標本照明，這些校正包括光源的校正。一個認真的顯微鏡工作者能熟練的對這些器件進行校正，并能針對標本的差異和物鏡的不同進行實踐。不正確的校正將嚴重地影響顯微鏡攝影照片的質量，使其產生斑點、虛光、色斑、襯度不良及其它各式各樣的缺陷。一些的顯微鏡配置了“預調中”燈泡不需要對燈泡進行調中，有一些顯微鏡甚至配置了橫向不能調整的聚光鏡。這類顯微鏡在出廠時已作了調整，在使用時不需作過多的調整。要使顯微鏡的照明處于*的狀態，在使用前應仔細閱讀產品的使用說明書或向廠家的技術代表仔細詢問相關的細節。
